Bakteri yaitu salah satu dari mikroorganisme yang mempunyai ukuran yang relatif kecil dan merupakan organisme uniselular (sel tunggal). Bakteri juga termasuk kelompok organisme prokariotik, lantaran materi genetiknya tidak diselubungi oleh membran inti. Bakteri mempunyai banyak sekali macam bentuk, umumnya terbagi menjadi tiga, yaitu bentuk basil (seperti batang), bentuk kokus (seperti bola atau oval), dan bentuk spiral. Ada juga basil yang mempunyai bentuk bintang dan kotak. Individu-individu basil sanggup hidup dengan membentuk pasangan, rantai, kluster, dan bentuk lainnya. Bentuk-bentuk tersebut sanggup menjadi dasar aksara suatu marga pada basil (Tortora dkk., 2010).
Sel basil mempunyai struktur dinding sel. Namun, struktur dinding sel pada basil berbeda dengan tumbuhan. Penyusun utama dinding sel pada basil yaitu peptidoglikan, sedangkan penyusun utama dinding sel pada tumbuhan yaitu selulosa (Tortora, 2010). Peptidoglikan yaitu sebuah polisakarida yang terdiri dari dua macam gula turunan, yaitu N-acetylglucosamine (NAG) dan N-acetylmuramic acid (NAM). Selain itu, peptidoglikan juga disusun oleh beberapa asam amino, ibarat D-alanine, L-alanine, D-glutamic acid, lysine atau struktur ibarat analog asam amino yang disebut DAP. Semua komponen tersebut dikoneksikan sehingga membentuk struktur berulang yang disebut glycan tetrapeptide (Madigan dkk., 2011).
Baca juga: Struktur dan Fungsi Dinding Sel Bakteri
Selain dinding sel, sel basil mempunyai struktur lain yang juga khas, ibarat kapsul, fimbriae, pili, flagela dan endospora. Kapsul merupakan lapisan polisakarida atau protein yang terletak di cuilan terluar dari sel. Kapsul secara khas berikatan dengan berpengaruh pada dinding sel atau berikatan secara kovalen pada peptidoglikan. Kapsul mempunyai fungsi ibarat media untuk melekatkan diri pada substrat padat dan mencegah sel dari kekeringan. Fimbriae dan pili yaitu struktur filamen yang terbuat dari protein dan memanjang dari permukaan sel. Fimbriae berfungsi untuk melekatkan pada permukaan atau membentuk biofilm pada permukaan. Sementara itu, pili merupakan struktur ibarat fimbriae, namun ukurannya lebih panjang dan jumlahnya lebih sedikit dibadingkan fimbriae. Pili berfungsi sebagai reseptor dari virus, memfasilitasi proses konjugasi, dan media untuk melekatkan sel pada jaringan inang (Madigan dkk., 2011).
Banyak basil sanggup bergerak dengan “berenang”. Pergerakan tersebut dibantu oleh struktur yang disebut flagela. Cara kerjanya yaitu dengan melaksanakan semacam rotasi atau putaran yang mengakibatkan sel sanggup ditarik dan didorong sehingga sel sanggup berpindah tempat. Flagela basil tersusun atas protein yang disebut flagellin. Endospora yaitu struktur khas yang biasanya muncul pada ketika sel basil berada di kondisi yang tidak memungkinkan untuk melaksanakan pertumbuhan. Endospora terdehidrasi dan mengandung sejumlah biro perlindungan ibarat kompleks calcium-diphicolinic acid dan acid-soluble protein, yang tidak ada pada sel vegetatifnya. Endospora sanggup tetap dorman hingga tak terbatas tetapi sanggup bergerminasi dengan cepat ketika kondisi memungkinkan (Madigan dkk., 2011).
Bakteri telah dikelompokkan oleh para hebat menurut tipe morfologi, fisiologi, dan genetikanya. Sejumlah taksa yang telah dikenal pada basil yaitu Proteobacteria, Actinobacteria, Spirochaetes, dan Cyanobacteria (Hogg, 2005). Selain pengelompokkan yang telah resmi diterima dalam taksonomi, terdapat juga jenis pengelompokkan tertentu yang didasarkan pada sifat yang khas dari sejumlah kelompok bakteri. Salah satu jenis pembagian basil tersebut yaitu dengan membagi basil menjadi basil gram nyata dan basil gram negatif (Hogg, 2005; Tortora dkk., 2010).
Perbedaan Bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif
Bakteri gram nyata dan basil gram negatif dibedakan menurut struktur dinding selnya. Akibat struktur dinding sel yang berbeda, mengakibatkan respon yang berbeda ketika dilakukan pewarnaan gram. Bakteri gram nyata mempunyai beberapa lapisan peptidoglikan sehingga lapisan peptidoglikannya tebal. Umumnya, 90% penyusun dinding sel basil gram nyata merupakan peptidoglikan. Dinding sel basil gram nyata mengandung teichoic acid. Ada dua tipe teichoic acid, yaitu lipoteichoic acid, yang menjangkau lapisan peptidoglikan dan terhubung ke membran plasma, dan wall teichoic acid, yang terhubung dengan lapisan peptidoglikan (Tortora dkk., 2010).
Berbeda halnya dengan basil gram negatif, yang mempunyai lapisan peptidoglikan lebih tipis. Namun, dinding sel basil gram negatif mempunyai membran luar. Membran luar terdiri dari lipopolisakarida (LPS), lipoprotein, dan fosfolipid. Peptidoglikan terikat dengan lipoprotein di membran luar dan periplasma, yaitu struktur ibarat gel yang berada di antara membran luar dan plasma membran. Selain itu, Dinding sel basil gram negatif tidak mengandung teichoic acid (Tortora dkk., 2010).
Perbedaan selanjutnya antara basil gram nyata dan basil gram negatif yaitu respon yang berbeda diantara keduanya ketika dilakukan pewarnaan gram. Bakteri gram nyata akan tetap terwarnai kristal violet ketika dilakukan dekolorisasi dengan alkohol dan basil akan menampakkan warna biru atau ungu. Sebaliknya, basil gram negatif akan terdekolorisasi dengan alkohol dan terganti dengan pewarna lawan (counterstain) ibarat safranin sehingga basil akan berwarna merah atau pink (Tortora dkk., 2010: 88).
Macam-Macam Pewarna Bakteri
Sel basil tidak berwarna sehingga sulit dan sukar diamati secara langsung. Untuk mempermudah pengamatan morfologi basil diharapkan pewarnaan. Proses pewarnaan basil lazim disebut pengecatan (Gandjar dkk., 1992). Zat yang digunakan untuk mewarnai basil termasuk biological dye. Zat pewarna/cat yang digunakan untuk mewarnai basil mempunyai dua sifat utama, yaitu mempunyai kelompok kromofor dan mempunyai ikatan dengan sel secara ionik, kovalen, atau hidrofobik. Kromofor merupakan gugus pemberi warna dari biological dye (Prescott dkk., 2002).
Zat warna sanggup dibedakan menjadi dua kelompok menurut sifat muatannya, yaitu pewarna asam (acidic dyes) dan pewarna basa (basic dyes). Pewarna basa terdiri dari methylen blue, basic fuchsin, crystal violet, safranin yang mempunyai muatan positif. Permukaan sel basil umumnya bermuatan negatif, sehingga pewarna basa sering digunakan dalam pengecatan struktur bakteri. Pewarna asam yakni eosin, rose bengal, acid fuchsin yang mempunyai muatan negatif (Prescott dkk., 2002). Pewarna asam tidak sanggup berikatan dengan kebanyakan basil lantaran muatan negatif pada zat warna akan ditolak dengan muatan negatif pada permukaan sel bakteri, sehingga pewarna asam mewarnai latar belakangnya (background) saja (Tortora dkk., 2010).
Ada tiga macam pengecatan yang umum digunakan, yaitu pengecatan negatif, pengecatan sederhana, dan pengecatan diferensial. Pengecatan negatif dilakukan untuk mewarnai latar belakang preparat dan basil tidak terwarnai. Pengecatan sederhana dilakukan dengan menggunakan satu macam larutan cat. Sel basil akan berwarna sesuai dengan jenis cat yang dipakai. Sementara itu, pengecatan diferensial dilakukan dengan menggunakan beberapa macam larutan zat. Hasil dari pengecatan diferensial mengelompokkan basil ke dalam kelompok-kelompok tertentu (Gandjar dkk., 1992).
Prinsip Pewarnaan Bakteri
Pengecatan negatif mempunyai prinsip dasar, yaitu dengan mengkontraskan latar belakang sel (dibuat menjadi lebih gelap) sehingga sel yang tidak bewarna menjadi lebih terlihat. Pewarna yang digunakan yaitu pewarna asam. Pengecatan negatif cocok digunakan untuk observasi bentuk sel, ukuran sel, dan kapsul (Tortora dkk., 2010).
Pengecatan sederhana menggunakan satu macam zat warna. Pengecatan sederhana biasanya digunakan untuk melihat bentuk dan susunan sel bakteri. Pewarna yang digunakan biasanya pewarna basa. Terkadang pada pengecatan sederhana digunakan zat mordant, yaitu zat yang sanggup meningkatkan afinitas antara cat dengan sel basil sehingga sel basil lebih terwarnai (Tortora dkk., 2010).
Pengecatan diferensial menggunakan beberapa zat warna dan balasannya sanggup mengelompokkan basil ke dalam kelompok basil tertentu. Salah satu macam pengecatan diferensial yaitu pengecatan gram. Pengecatan gram menggunakan empat macam larutan. Larutan pertama yaitu cat utama, yaitu kristal violet. Larutan kedua yaitu mordant, yaitu Gram's iodine. Mordant berfungsi untuk meningkatkan afinitas antara cat dengan sel bakteri. Mordant akan berikatan berpengaruh dengan kristal violet. Setelah diberi mordant, baik basil gram nyata maupun negatif, akan tampak berwarna ungu atau biru. Larutan ketiga yaitu zat pendekolorisasi, yaitu etanol atau aseton. Fungsi zat pendekolorisasi yaitu untuk meluruhkan warna ungu pada basil gram negatif, sedangkan basil gram nyata tetap berwarna ungu. Larutan keempat yaitu zat pewarna lawan (counter stain), yaitu safranin. Fungsi zat pewarna lawan yaitu akan memperlihatkan warna pink pada basil gram negatif, sedangkan pada basil gram nyata tetap berwarna ungu (Benson, 2001; Tortora dkk., 2010).
Pewarnaan Negatif
Pengecatan negatif menggunakan tinta cina atau nigrosin. Tinta cina atau nigrosin merupakan jenis pewarna asam dan bermuatan negatif. Tinta cina tidak akan bisa berikatan dengan dinding sel dari basil lantaran sama-sama bermuatan negatif, sehingga tinta cina hanya akan mewarnai permukaan preparat atau dengan kata lain menciptakan gelap latar belakang dari bakteri. Prinsip dari pengecatan negatif yaitu menciptakan kontras latar belakang objek sehingga objek yang transparan dan tidak terwarnai menjadi lebih terang terlihat (Benson, 2001; Harley & Prescott, 2002; Tortora dkk., 2010).
Pengecatan negatif tidak memerlukan proses fiksasi terlebih dahulu, lantaran proses fiksasi sanggup menciptakan sel menjadi mengkerut. Biasanya, pengecatan negatif berfungsi untuk melihat bentuk, ukuran dan kapsul sel. Jika pada pengecatan negatif dilakukan juga proses fiksasi, akan menciptakan perubahan pada ukuran sel sehingga ukuran sel menjadi tidak akurat. Lagipula, salah satu fungsi dari proses fiksasi yaitu untuk menciptakan proses pewarnaan basil menjadi lebih baik. Sementara itu, pengecatan negatif hanya mewarnai latar belakang dan tidak akan mewarnai permukaan sel sehingga proses fiksasi tidak perlu dilakukan (Benson, 2001).
Faktor-faktor yang memengaruhi proses pewarnaan yaitu faktor warna, dinding sel bakteri, dan proses pewarnaan. Cat atau pewarna bisa bersifat asam atau basa, selanjutnya pemakaiannya diadaptasi dengan pengecatan yang akan dibuat. Jika akan melaksanakan pengecatan negatif, pewarna yang digunakan yaitu pewarna asam lantaran pewarna asam tidak akan berikatan dengan dinding sel. Sementara itu, proses pewarnaan sanggup memengaruhi baik tidaknya hasil pengecatan (Benson, 2001; Harley & Prescott, 2002).
Pewarnaan Sederhana
Contoh pewarnaan sederhana dengan menggunakan crystal violet. Permukaan sel basil akan menjadi berwarna ungu sesudah diwarnai dengan pewarna crystal violet. Crystal violet yaitu jenis pewarna basa yang bermuatan nyata sehingga sanggup berikatan dengan permukaan sel basil (Tortora dkk., 2010).
Sebelum melaksanakan proses pewarnaan sederana, perlu dilakukan proses fiksasi. Proses fiksasi mempunyai fungsi yang banyak dalam membantu proses pengecatan menjadi lebih baik. Salah satu fungsi dari fiksasi yaitu sanggup menginaktivasi enzim yang sanggup merusak morfologi sel atau menguatkan struktur sel sehingga sanggup menyulitkan proses pewarnaan. Selain itu, fiksasi sanggup mempertahankan posisi sel, membunuh sel, dan melekatkan sel dengan preparat sehingga sel basil tidak hilang ketika proses pembersihan (Benson, 2001). Fiksasi dilakukan dengan cara melewatkan gelas objek di atas nyala api sebanyak 3-4 kali (Gandjar dkk., 1992).
Faktor-faktor yang memengaruhi pewarnaan sederhana yaitu faktor cat, permukaan sel basil itu sendiri, dan faktor proses pewarnaan. Cat dan permukaan sel basil harus yang mempunyai ion yang berlawanan sehingga cat sanggup berikatan dengan permukaan sel bakteri. Sebagai contoh, crystal violet yang mempunyai ion bermuatan nyata akan berikatan dengan permukaan sel basil yang umumnya mempunyai ion bermuatan negatif. Proses pewarnaan sederhana yang cukup penting yaitu pada ketika proses fiksasi. Pengerjaan proses fiksasi yang tidak benar akan menciptakan pengecatan menjadi kurang baik, contohnya sel basil masih hidup, sel basil hilang ketika proses pencucian, dan sel tidak bisa diwarnai oleh zat pewarna (Benson, 2001; Prescott dkk., 2002; Tortora dkk., 2010).
Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram menggunakan empat jenis larutan, yaitu larutan gram A, gram B, gram C, dan gram D. Setiap larutan tersebut mempunyai fungsi masing-masing yang dijelaskan sebagai berikut:
- Larutan gram A adalah cat utama, yaitu kristal violet.
- Larutan gram B yaitu mordant, yaitu Gram's iodine. Mordant berfungsi untuk meningkatkan afinitas antara cat dengan sel bakteri. Mordant akan berikatan berpengaruh dengan kristal violet. Setelah diberi mordant, baik basil gram nyata maupun negatif, akan tampak berwarna ungu atau biru.
- Larutan gram C yaitu zat pendekolorisasi, yaitu etanol atau aseton. Fungsi zat pendekolorisasi yaitu untuk meluruhkan warna ungu pada basil gram negatif, sedangkan basil gram nyata tetap berwarna ungu.
- Larutan gram D yaitu zat pewarna lawan (counter stain), yaitu safranin. Fungsi zat pewarna lawan yaitu akan memperlihatkan warna pink atau merah pada basil gram negatif, sedangkan pada basil gram nyata tetap berwarna ungu (Benson, 2001; Tortora dkk., 2010).
Kompleks iodin-kristal violet akan terbentuk di dalam sel pada pewarnaan sel. Kompleks iodin-kristal violet akan terekstraksi oleh alkohol dari basil gram negatif, namun tidak pada basil gram positif. Hal tersebut disebabkan basil gram nyata mempunyai lapisan peptidoglikan yang tebal. Peptidoglikan akan terdehidrasi oleh alkohol, menyebakan pori dinding tertutup dan mencegah kompleks iodin-kristal violet tidak keluar dari sel. Sebaliknya, pada basil gram negatif, alkohol berpenetrasi melewati LPS dan mengekstraksi kompleks iodin-kristal violet. Sebagai hasilnya, basil gram negatif akan terlihat tidak berwarna dan akan terwarnai oleh zat pewarna lawan (safranin), sedangkan basil gram nyata akan tetap berwarna ungu (Madigan dkk., 2011).
Faktor-faktor yang memengaruhi proses pewarnaa gram yaitu faktor cat, faktor dinding sel, dan proses pewarnaan. Cat yang digunakan dihentikan yang sudah usang lantaran sanggup memengaruhi hasil pengecatan. Struktur dinding sel juga memengaruhi hasil pengecatan, lantaran struktur dinding sel pada basil gram nyata dan basil gram negatif berbeda. Proses pengecatan sel juga harus diperhatikan, contohnya pada tahap fiksasi dan pencucian. Umur biakan yang digunakan juga dihentikan yang sudah tua, lantaran biakan yang sudah renta lebih gampang terdekolorisasi dibandingkan biakan yang masih muda sehingga basil gram nyata bisa terlihat ibarat basil gram negatif (Benson, 2001; Tortora dkk., 2010; Madigan dkk., 2011).
Referensi
- Black, J. G. 2008. Microbiology, 7th ed.
- Benson. 2001. Microbiological application lab manual, 8th ed.
- Harley & Prescott. 2002. Laboratory exercises in microbiology, 5th ed.
- Hogg, S. 2005. Essential microbiology.
- Bergey's manual of systematic bacteriology: vol III The Firmicutes, 2nd ed.
- Madigan, M. T., J. M. Martinko, D. A. Stahl, D. P. Clark. 2011. Brock biology of microorganisms, 13th ed.
- Prescott, L. M., Harley, & Klein. 2002. Microbiology, 5th ed.
- Tortora, G. J., B. R. Funke & C. L. Case. 2010. Microbiology: An introduction, 10th ed.
