Real Time PCR ialah teknik yang dipakai untuk memonitor progress reaksi PCR pada waktu yang sama (Biosoft, 2007). RT-PCR juga dikenal sebagai quantitative PCR (qPCR). Jumlah produk PCR (DNA, cDNA atau RNA) yang relatif sedikit, sanggup dihitung secara kuantitatif.
Prinsip kerjanya didasarkan pada deteksi fluoresensi yang diproduksi oleh molekul reporter yang meningkat sejalan dengan berlangsungnya proses PCR. Hal ini terjadi alasannya ialah akumulasi produk PCR pada tiap siklus amplifikasi. Molekul reporter dengan fluoresensi mencakup pewarna yang berikatan pada double-stranded DNA (menggunakan SYBR®Green atau EvaGreen®Reagents ) atau memakai probe spesifik sekuens/sequence specific probes (Molecular Beacons or TaqMan® Probes).
 |
| Gambar 1. Contoh Mesin Real Time PCR |
Analisis memakai Real time PCR mempunyai sensitivitas tinggi dan lebih spesifik untuk produk PCR tertentu. Real time PCR juga mencakup Real Time-RT PCR dimana PCR dilakukan secara Real Time memakai enzim Reverse Transcriptase secara eksklusif pada waktu yang bersamaan. Real Time-RT PCR mempunyai aksesori siklus Reverse Transcription yang memacu perubahan molekul DNA dari molekul RNA. Real Time-RT PCR dibutuhkan alasannya ialah RNA kurang stabil dibandingkan dengan DNA.
 |
| Gambar 2. Proses Real Time PCR pada deteksi sasaran non-spesifik (Fraga et al., 2008). |
Pada mekanisme Real Time PCR, molekul reporter dengan fluoresensi (pada Gambar 2 ditunjukkan dengan bab berwarna hijau) dipakai untuk memonitor proses PCR. Fluoresensi akan dipendarkan oleh molekul sebagaimana terakumulasinya produk PCR pada tiap siklus proses amplifikasi. Berdasar pada molekul yang dipakai untuk deteksi, teknik Real Time PCR sanggup dibedakan sebagai berikut:
1. Deteksi sasaran non-spesifik memakai pewarnaan DNA
Pada Real Time PCR, pewarna DNA dipakai sebagai reporter fluoresensi untuk memonitor reaksi Real Time PCR. Fluoresensi pada reporter akan terakumulasi seiring dengan proses amplifikasi yang berlangsung. Pencatatan secara kuantitatif dilakukan dengan menghitung pancaran fluresensi tiap siklus PCR. Hal tersebut mungkin untuk dilakukan guna memonitor reaksi PCR selama fase eksponensial. Jika grafik digambarkan antara log jumlah awal template dan kekerabatan peningkatan fluoresensi reporter selama proses Real Time PCR, maka akan didapatkan suatu garis kekerabatan yang menawarkan kuantitas gen yang diekspresikan.
2. Deteksi sasaran spesifik
Deteksi sasaran spesifik Real Time PCR dilakukan memakai beberapa probe oligonucleotide yang dilabeli pada dua bab reporter dengan label (pewarna) fluoresensi/fluorescent dye dan pewarna quencher/ quencher dye.
Kuantitas mRNA dalam sel merupakan parameter jumlah gen yang terekspresi. Untuk menganalisa tingkat lisan gen, cDNA yang telah disintesis dari mRNA diuji secara kuantitatif memakai real time PCR. Analisis hasil real time PCR sanggup dilakukan secara absolute quantification dan relative quantitation. Metode relative quantitation atau yang dikenal juga dengan comparative threshold method menghilangkan kebutuhan akan kurva standar yang dipakai dalam perhitungan absolute quantification dan memakai perhitungan secara matematika untuk mengukur tingkat kuantitatif relatif lisan dari gen sasaran dengan memakai gen rujukan dan kalibrator dari jaringan (Arya et al., 2005).
Untuk mengetahui lisan suatu gen maka dibutuhkan gen rujukan sebagai pembanding internal (endogenous control) jumlah DNA biar tidak terjadi kesalahan interpretasi akhir jumlah DNA yang berbeda. Gen rujukan yang dipakai ialah gen yang tidak tergoda oleh lingkungan. Gen yang paling banyak dipakai ialah housekeeping gene menyerupai actin dan gliseraldehida-3-fosfat-dehidrogenase (GAPDH) (Bustin, 2000).
Hasil real time PCR dengan metode comparative threshold mencakup nilai Cq dan relative quantitation. Cq merupakan hasil fraksi jumlah siklus PCR dimana nilai reporter fluoresensi lebih besar dari tingkat deteksi minimal mesin real time PCR sehingga amplicon meningkat secara signifikan. Nilai Cq didapat dari jumlah siklus pada proses PCR yang berpotongan dengan garis threshold. Threshold ialah garis yang menandai peningkatan sinyal fluoresensi secara signifikan menurut variabilitas baseline, namum posisi threshold sanggup diatur bebas pada setiap titik di fase eksponensial (Life TechnologiesTM, 2012).
Nilai relative quantitation dihitung menurut satuan massa dengan rasio nilai Cq kalibrator dengan Cq sampel dengan bentuk rumus:
Rasio(sampel/kalibrator) = ECq (kalibrator)-Cq (sampel)
E ialah nilai efisiensi amplifikasi yang menjelaskan berapa banyaknya sasaran yang diproduksi dalam setiap siklus PCR. Jika proses PCR efisien 100%, maka setiap siklus akan memproduksi dua kali lipat hasil dari template semula. E bernilai 2 kalau amplifikasi PCR 100% efisien (Bio-Rad, 2006). Jika E bernilai 2, maka perhitungannya menjadi sebagai berikut:
Rasio(sampel/kalibrator) = 2Cq (kalibrator)-Cq (sampel) ;atau
Rasio(sampel/kalibrator) = 2DCq ; dimana DCq = Cq(kalibrator) – Cq(sampel)
Analisis relative quantitation menggunakan gen rujukan yang umum dipakai ialah Livak Method atau yang dikenal juga dengan metode 2-DDCq dan metode Pfaffl. Pada metode ini diperlukan formula rumus alternatif untuk memilih lisan relatif gen sasaran pada sampel yang berbeda-beda (Pfaffl, 2001).
Untuk memilih rasio antara sampel dan kalibrator, dipakai rumus berikut ini:
Aplikasi dari Real Time PCR (Biosoft, 2007) antara lain dipakai sebagai studi expresi gen secara kuantitatif, penghitungan jumlah copy DNA (cDNA) pada genom atau DNAs virus, analisis pembedaan alel atau genotiping Single Nucleotide Polymorphism SNP, untuk verifikasi hasil microarray, keefektifan obat terapi, penghitungan kerusakan DNA.
Perbedaan Real Time PCR dan PCR biasa yaitu, dengan Real Time PCR deteksi produk PCR sanggup dihasilkan pada fase awal reaksi. PCR biasa hanya memakai Electrophoresis gel untuk deteksi produk amplifikasi PCR pada fase akhir, tanpa mengetahui jumlah produk PCR yang diekspresikan atau dihasilkan.
