Dalam ilmu biologi melekular, kegiatan memotong DNA yaitu salah satu kegiatan yang sering dilakukan. Pemotongan DNA sanggup memakai enzim endonuklease yang sering dilakukan dalam teknik biologi molekuler dengan memakai DNA sebagai materi kajian.
Enzim endonuklease yang memutus ikatan fosfodiester pada DNA dikelompokakan kedalam nuklease. Enzim nuklease dibagi menjadi dua yakni eksonuklease yang memutus ikatan fosfodiester mulai dari ujung rantai DNA dan endonuklease yang memutus ikatan fosfodiester pada bab dalam rantai DNA.
Enzim endonuklease restriksi mengkatalisis pemotongan DNA pada bab dalam rantai DNA yang ditandai dengan adanya urutan nukleotida (4-6 bp) yang khas.
Urutan nukleotida yang dikenali oleh enzim tersebut sering disebut sebagai urutan palindromic, yakni urutan yang apabila dibaca dari kiri ke kanan sama dengan urutan bila dibaca dari kanan ke kiri, contohnya 5’AATT 3’ dan 3’TTAA 5’.
Ada banyak sekali jenis endonuklease restriksi yang berhasil diisolasi dan sanggup dibeli secara komersial, antara lain: EcoR I, Hind III, BamH 1, Sal 1 dan lain-lain yang sudah pernah diulas di goresan pena sebelumnya: Enzim Restriksi. Enzim tersebut umumnya bekerja optimal pada suhu 37°C dan dalam buffer dengan pH optimum.
 |
| Gambar 1. Sekuens Palindromik. |
DNA yang akan diputus ikatan fosfodiesternya oleh enzim tersebut harus mempunyai urutan yang khas yang dikenali oleh enzim yang digunakan. Untuk mengetahui enzim tersebut bekerja secara baik, maka diharapkan sampel kontrol aktual (DNA yang terperinci mengandung tempat restriksi untuk enzim yang digunakan) dan kontrol negatif (DNA yang tidak diberi enzim yang akan diuji dengan sampel kita).
Apabila yang digunakan sebagai sampel DNA yaitu DNA genom maka tunjangan endonuklease restriksi akan mengakibatkan fragmen DNA yang ukurannya bervariasi. Jika yang digunakan DNA plasmid (ukurannya jauh lebih kecil) yang mempunyai tempat yang bisa dikenali endonuklease restriksi maka akan didapatkan sejumlah fragmen DNA tergantung dari banyaknya tempat restriksi pada DNA plasmid tersebut.
Sebagai teladan DNA yang dipotong yaitu DNA plasmid (pGAS102) dan tumbuhan. Enzim yang bisa memotong untaian DNA pGAS102 dan DNA tumbuhan yaitu enzim nuklease. Atau disebut deoksiribonuklease atau Dnase (Howe, 2007). Salah satu enzim yang digunakan untuk memotong DNA tersebut yaitu enzim restriksi nuklease. Enzim ini bisa memotong DNA pada urutan yang spesifik. Dalam kegiatan praktikum ini digunakan enzim restriksi endonuklease berupa BamHI yang merupakan enzim restriksi tipe II. Enzim restriksi tipe II hanya mempunyai kegiatan restriksi dengan kofaktor berupa Mg2+, sementara kegiatan metilasi dilakukan oleh enzim metilase (Reece, 2004).
Enzim BamHI ini mempunyai kofaktor berupa ion Mg2+, sehingga dalam mekanisme praktikum restriksi plasmid diberi MgCl. Kation bivalen Mg2+ dari MgCl tersebut berfungsi dalam proses pemotongan plasmid yang dibutuhkan untuk meningkatkan kegiatan enzim restriksi (Ausubel, 2003; Reece, 2004). Adapun kinerja enzim BamHI tersebut bisa memotong ikatan fosfodiester pada urutan DNA pada sisi:
5′ G↓G-A-T-C-C 3′
3′ C-C-T-A-G↑G 5′
Enzim restriksi tersebut bisa mengenali urutan nukleotida yang sama (G-G), sehingga BamHI disebut juga sebagai isoschizomer. Hasil pecahan oleh enzim BamHI berupa gugusan 5′–PO4– dan 3′–OH yang bab terminalnya berbentuk asimetris atau sticky ends. (Ausubel, 2003; Becker et al., 1996).
Enzim BamHI bekerja dengan cara melaksanakan scanning sekuens non-spesifik di sepanjang DNA dengan cara meluncur (sliding), sesudah itu saat enzim tersebut menemukan sekuens spesifik berupa 5′ G-G-A-T-C-C 3′ maka akan berupa konformasinyan dan sisi katatiliknya bekerja untuk memotong ikatan fosfodiester antara nukleotida G menjadi fragmen yang terpisah (Allison, 2007).
Pada tahap pemotongan plasmid pGAS102 dan genom tumbuhan, selain diberi enzim restriksi BamHI juga diberi buffer yang terdiri dari 500mM Tris-HCl pH 7.5, 100mM MgCl2, 10mM Dithiothreitol (DTT), dan 100mM NaCl. Buffer Tris-HCl digunakan untuk mempertahankan keoptimalan pH enzim. Hal ini dikarenakan Tris-HCl merupakan buffer dengan rentang pH 7-9 yang secara tipikal bisa mempertahankan keadaan fisiologis menyerupai dalam sel (Ausubel, 2003).
Kombinasi Tris-HCl dan NaCl akan mengaktifkan kinerja enzim endonuklease. Selain itu, adanya MgCl2 menyerupai yang dijelaskan sebelumnya bisa menunjukkan konstribusi ion bivalen berupa Mg2+ yang bertindak sebagai kofaktor enzim BamHI yang bertujuan supaya meningkatkan kinerja enzim tersebut (Ausubel, 2003; Reece, 2004).
Adapun fungsi ¬Dithiothreitol (DTT) selain sebagai buffer, DTT juga mempunyai fungsi sebagai penstabil terhadap oksidasi oleh udara atau antioksidan yang bertujuan supaya DNA tidak mengalami kerusakan oksidatif selam proses restriksi (Sambrook et al., 2001; Wilson&Walker, 2010).
Penulis:
Mh Badrut Tamam, M. Sc.
email: mh.badruttamam@generasibiologi.com
Penulis:
Mh Badrut Tamam, M. Sc.
email: mh.badruttamam@generasibiologi.com
