Elektroforesis merupakan proses migrasi molekul bermuatan dalam medium yang dialiri arus listrik (Holme dan Hazel, 1998). Westermeier (2005) menjelaskan bahwa prinsip dasar elektroforesis ialah molekul dan partikel bermuatan akan bergerak ke arah elektrode yang mempunyai muatan berlawanan di bawah dampak medan listrik. Laju migrasi molekul bermuatan tersebut menuju elektrode yang bermuatan negatif disebut elektromobilitas.
Elektromobilitas suatu molekul dipengaruhi oleh beberapa faktor, sebagaimana yang dijabarkan oleh Switzer (1999) bahwa semakin besar muatan molekul maka semakin besar pula elektromobilitasnya, nilai elektromobilitas berbanding terbalik dengan besar ukuran molekul sehingga molekul dengan ukuran lebih besar mempunyai elektromobilitas yang lebih kecil kalau dibandingkan dengan molekul yang berukuran lebih kecil. Selain besar muatan dan ukuran molekul tersebut, topologi atau bentuk molekul turut kuat pula terhadap elektromobilitas suatu molekul.
Elektroforesis DNA umumnya memakai metode elektroforesis gel agarosa (Karp, 2008). Metode elektroforesis tersebut pada prinsipnya melibatkan fase stasioner yang berupa gel agarosa dan fase gerak berupa buffer Tris-acetate EDTA (TAE) atau Tris-borat EDTA (TBE) (Switzer, 1999). TBE (Tris-borat EDTA) 1X, Tris/Borat ialah buffer yang umum dipakai sebagai buffer elektroforesis alasannya mempunyai kapasitas buffering yang tinggi pada titik isoelektriknya (Ausubel, et al., 2003). Borat bertindak sebagai conducting ion sehingga sanggup mempertahankan kesetimbangan ion H+ dan OH- yang dihasilkan oleh elektroda, hal ini bekerjasama dengan fungsi buffer dalam menjaga kesetimbangan pH dikala migrasi fragmen DNA berlangsung, perubahan pH sanggup mendenaturasi struktur DNA sehingga mengubah elektromobilitas DNA (Martin, 1996). Contoh alat eletroforesis berada pada Gambar 1.
Elektromobilitas suatu molekul dipengaruhi oleh beberapa faktor, sebagaimana yang dijabarkan oleh Switzer (1999) bahwa semakin besar muatan molekul maka semakin besar pula elektromobilitasnya, nilai elektromobilitas berbanding terbalik dengan besar ukuran molekul sehingga molekul dengan ukuran lebih besar mempunyai elektromobilitas yang lebih kecil kalau dibandingkan dengan molekul yang berukuran lebih kecil. Selain besar muatan dan ukuran molekul tersebut, topologi atau bentuk molekul turut kuat pula terhadap elektromobilitas suatu molekul.
Elektroforesis DNA umumnya memakai metode elektroforesis gel agarosa (Karp, 2008). Metode elektroforesis tersebut pada prinsipnya melibatkan fase stasioner yang berupa gel agarosa dan fase gerak berupa buffer Tris-acetate EDTA (TAE) atau Tris-borat EDTA (TBE) (Switzer, 1999). TBE (Tris-borat EDTA) 1X, Tris/Borat ialah buffer yang umum dipakai sebagai buffer elektroforesis alasannya mempunyai kapasitas buffering yang tinggi pada titik isoelektriknya (Ausubel, et al., 2003). Borat bertindak sebagai conducting ion sehingga sanggup mempertahankan kesetimbangan ion H+ dan OH- yang dihasilkan oleh elektroda, hal ini bekerjasama dengan fungsi buffer dalam menjaga kesetimbangan pH dikala migrasi fragmen DNA berlangsung, perubahan pH sanggup mendenaturasi struktur DNA sehingga mengubah elektromobilitas DNA (Martin, 1996). Contoh alat eletroforesis berada pada Gambar 1.
Gambar 1. Alat elektroforesis (Ausubel et al., 2003).
Agarosa merupakan polisakarida turunan yang didapat dari alga merah (Miesfeld, 1999). Gel agarose sanggup dipakai untuk memisahkan DNA berukuran lebih dari 100 bp, sedangkan untuk memisahkan DNA dengan ukran lebih pendek sanggup dipakai gel poliakrilamid (Wilson dan John, 1994). Gel agarose merupakan fase membisu dalam pemisahan fragmen DNA, konsentrasi agarose yang dipakai dalam pemisahan fragmen DNA sangat menghipnotis mobilitas fragmen DNA, semakin besar konsentrasi agarose yang dipakai maka semakin kecil pori-pori gel, dan semakin kecil konsentrasi agarose maka semakin besar pori-pori gel. Perangkat dalam elektroforesis gel agarosa diantaranya terdiri dari power supply sebagai sumber arus listrik; cetakan gel; sisir yang dipakai untuk menciptakan sumuran daerah peletakan DNA yang akan dielektroforesis. Pembuatan sumuran ini dilakukan dengan meletakkan sisir pada gel sebelum gel memadat; tangki elektroforesis; dan elektrode(Martin, 1996).
Pemisahan fragmen DNA menurut elektromobilitas mempunyai kegunaan sebagai metode analitik maupun preparatif, molekul DNA yang bermuatan negatif alasannya adanya gugus fosfat akan bergerak menuju anode (elektrode bermuatan positif) dikala dipisahkan dengan elektroforesis (Miesfeld, 1999). Fragmen DNA yang mempunyai ukuran molekul yang sama akan mempunyai elektromobilitas yang sama dan menempuh jarak migrasi yang sama pula (Gilbert, 2000). Proses running elektroforesis DNA sampel bersamaan dengan DNA yang telah diketahui ukurannya (standard) sanggup mempunyai kegunaan dalam analisis besar ukuran DNA dalam sampel (Switzer, 1999) (Gambar 2).
Maloy et al. (1994) menjelaskan bahwa topologi DNA yang dipisahkan memilih elektromobilitas DNA. DNA yang mengalami supercoil akan bermigrasi lebih cepat alasannya strukturnya sangat kompak. DNA yang akan dielektroforesis pada umumnya dicampur dengan loading dye yang berfungsi untuk memonitor mobilitas elektroforesis, loading dye bermigrasi bersama molekul DNA selama proses running elektroforesis. bromphenol blue dan xylenecyanol merupakan jenis loading dye yang umum dipakai dalam elektroforesis DNA, bromphenol blue sanggup bermigrasi bersama dengan molekul DNA berukuran 0,5 kb sedangkan xylenecyanol sanggup bermigrasi bersama molekul DNA berukuran 5 kb (Ausubel et al., 2003).
Pemisahan fragmen DNA menurut elektromobilitas mempunyai kegunaan sebagai metode analitik maupun preparatif, molekul DNA yang bermuatan negatif alasannya adanya gugus fosfat akan bergerak menuju anode (elektrode bermuatan positif) dikala dipisahkan dengan elektroforesis (Miesfeld, 1999). Fragmen DNA yang mempunyai ukuran molekul yang sama akan mempunyai elektromobilitas yang sama dan menempuh jarak migrasi yang sama pula (Gilbert, 2000). Proses running elektroforesis DNA sampel bersamaan dengan DNA yang telah diketahui ukurannya (standard) sanggup mempunyai kegunaan dalam analisis besar ukuran DNA dalam sampel (Switzer, 1999) (Gambar 2).
Maloy et al. (1994) menjelaskan bahwa topologi DNA yang dipisahkan memilih elektromobilitas DNA. DNA yang mengalami supercoil akan bermigrasi lebih cepat alasannya strukturnya sangat kompak. DNA yang akan dielektroforesis pada umumnya dicampur dengan loading dye yang berfungsi untuk memonitor mobilitas elektroforesis, loading dye bermigrasi bersama molekul DNA selama proses running elektroforesis. bromphenol blue dan xylenecyanol merupakan jenis loading dye yang umum dipakai dalam elektroforesis DNA, bromphenol blue sanggup bermigrasi bersama dengan molekul DNA berukuran 0,5 kb sedangkan xylenecyanol sanggup bermigrasi bersama molekul DNA berukuran 5 kb (Ausubel et al., 2003).
Gambar 2. Mobilitas molekul DNA dalam biar pada dikala running.
Hasil elektroforesis sanggup divisualisasi dengan memakai pewarna fluoresensi ethidium bromide (EtBr) (Gilbert, 2000). Secara teknis, sehabis proses running, gel direndam dalam larutan buffer TBE atau TAE yang mengandung ethidium bromide, selanjutnya ethidium bromide akan berdifusi ke dalam gel dan berasosiasi dengan DNA (Switzer, 1999). Ethidium bromide bisa berinterkalasi diantara pasang basa nukleotida pada struktur double heliks (Gambar 3) dan dikala gel hasil elektroforesis disinari dengan ultraviolet maka fragmen-fragmen DNA yang telah terpisah tampak sebagai band-band berwarna oranye (Campbell dan Shawn, 2009).
Gambar 3. Interkalasi ethidium bromide dalam molekul DNA.
Referensi:
- Ausubel, F. M. et al. 2003. Current Protocols in Molecular Biology.
- Campbell, M. K. and Shawn F. 2009. Biochemistry.
- Clark, Melody S. 1997. Plant molecular biology: A laboratory manual. Berlin
- Davis, L., Michael K., and James B. 1994. Basic methods in molecular biology.
- Holme, D. J. and Hazel P. 1998. Analytical biochemistry. England.
- Gilbert, H. F. 2000. Basic concepts in biochemistry.
- Maloy, S. R., John E. C. Jr., and David F. 1994. Microbial genetics.
- McPherson, Michael J. and Simon G. Møller. 2006. PCR, 2nd ed.
- Karp, Gerald. 2008. Cell and molecular biology.
- Kirby, Lorne T. 1992. DNA Fingerprinting.
- Lehninger, A.L. et al. Cox, 2000. Principles of Biochemistry, 3rd ed.
- Martin, Robin. 1996. Gel electrophoresis: Nucleic acids.
- Miesfeld, Roger L. 1999. Applied Molecular Genetics.
- Switzer. 1999. Experimental Biochemistry.
- Pierce, Benjamin A. 2002. Genetics.
- Westermeier, Reiner. 2005. Electrophoresis in Practice.
- Wilson, K. and John M. W. 1994. Principles and Techniques of Practical Biochemistry.
- Zyskind, J. W. and Sanford I. B. 1992. Recombinant DNA Laboratory Manual.
