Observasi mikroskopis suatu preparat histologi sanggup berasal dari jaringan normal maupun jaringan yang mengidap sesuatu penyakit tertentu (patologis) akan mempunyai hasil yang lebih baik kalau dalam proses pembuatannya dilakukan dengan persiapan yang baik, proses penyayatan dilakukan cukup tipis, donasi pewarnaan yang sesuai, sehingga karenanya mencerminkan banyak sekali elemen jaringan yang diteliti supaya lebih gampang untuk diamati. Alhasil, tidak hanya penelitian secara mikroanatomi yang sanggup dilakukan, namun sanggup memperlihatkan citra mengenai perbedaan banyak sekali perubahan yang terjadi pada sel-sel jaringan yang diamati. Beberapa jenis jaringan terkadang memerlukan perlakuakan yang khusus untuk sanggup menelitinya, sebagai pola jenis pewaranaan yang digunakan harus sesuai dengan jenis jaringan tertentu.
Perlakuan dan cara pembuatan preparat berbeda-beda sesuai dengan sifat dan tipe jaringan yang akan digunakan. Beberapa metode pembuatan preparat antara lain adalah:
- Metode oles (smear method). Suatu tahapan dengan memakai selaput film dari substansi suatu spesimen yang berupa cairan maupun bukan cairan yang diletakkan di atas gelas objek (object glass) yang bersih, kemudian dilakukan fiksasi, pewarnaan dan selanjutnya ditutup dengan cover glass. Metode smear biasanya digunakan untuk pembuatan preparat darah.
- Metode rentang (spread method). Metode rentang dilakukan dengan merentangkan jaringan pada object glass, sehingga sanggup diamati di bawah mikroskop. Metode rentang umum digunakan untuk mengamati jaringan yang berbentuk selaput mirip selaput penggantung usus.
- Metode tekan (squash method) Metode tekan digunakan untuk mendapat jaringan yang selnya gampang lepas, mirip tumor seluler. Cara yang dilakukan yaitu dengan menekan potongan jaringan atau organisme kecil secara keseluruhan, sehingga karenanya berupa sediaan yang tipis supaya sanggup diamati di bawah mikroskop.
- Metode supravital. Metode supravital dilakukan dengan mengisolasi jaringan hidup. Metode tersebut cenderung mengacu kepada pewarnaan supravital yang dilakukan pada sel atau jaringan hidup.
- Metode irisan. Metode irisan ini dilakukan dengan memakai irisan atau sayatan jaringan yang mempunyai ketebalan tertentu dengan tujuan sanggup diamati melalui mikroskop dengan jelas. Metode irisan mempunyai dua cara yakni metode irisan dengan tangan dan metode irisan dengan mikrotom. Dalam proses pengirisan, perbedaan perlakuan untuk mendapat potongan jaringan terdiri dari banyak sekali metode yakni: metode beku, metode seloidin, metode parafin, dan metode penanaman rangkap.
Metode Preparasi
Metode preparasi histologi dilakukan melalui beberapa tahap, yaitu : 1. Fiksasi (fixation)
2. Dehidrasi (dehydration)
3. Penjernihan (clearing)
4. Pembenaman (infiltration)
5. Pengecoran (blocking)
6. Pengirisan jaringan (sectioning)
7. Pewarnaan (staining),
1. Fiksasi
Proses pertama yang dilakukan yakni dalam menyiapkan materi segar yaitu fiksasi. Fiksasi yakni proses untuk memertahankan bagian-bagian sel atau jaringan supaya tetap berada pada tempatnya serta tidak mengalami perubahan bentuk maupun ukuran. Media yang digunakan untuk fiksasi desebut dengan fiksatif (Gunarso, 1986). Fiksasi merupakan tahapan yang bertujuan untuk mengeraskan jaringan terutama jaringan lunak supaya sanggup memudahkan dalam pembuatan irisan tipis (Jusuf, 2009). Fiksasi dilakukan dengan merendam jaringan dalam larutan fiksatif mirip formalin, buffer formalin, paraformaldehid 4%, asam asetat, merkuri klorida, asam pikrat, larutan Bouin, larutan Muller dan larutan Carnoy (Hewitson, 2009; Zulham, 2009).
Efek fiksasi terhadap jaringan yang diproses antara lain: menghambat proses pembusukan yang disebabkan oleh basil dan autolisis akhir enzim proteolitik dalam jaringan tersebut, mengawetkan jaringan sehingga susunan jaringan mendekati kondisi sewaktu hidup, mengeraskan jaringan, merubah konsistensi sel yang setengah cair menjadi lebih padat, mengubah indeks refraksi sehingga mempermudah pengamatan, dan memengaruhi reaksi histokimia supaya jaringan lebih gampang terwarnai. Hal-hal yang harus diperhatikan dalam proses fiksasi, antara lain: tebal irisan jaringan, volume larutan fiksatif, jenis larutan fiksatif yang digunakan, pH, suhu, dan usang waktu fiksasi (Zulham, 2009).
2. Dehidrasi
Proses selanjutnya dalam pembuatan preparat yakni dehidrasi. Dehidrasi merupakan proses yang bertujuan untuk mengeluarkan kandungan air dalam jaringan dengan memakai medium tertentu (parafin atau zat lainnya) yang digunakan untuk menciptakan blok prerparat sanggup mengganti atau mengisi daerah air di dalam jaringan atau menyerap masuk ke dalam jaringan (Zulham, 2009; Jusuf, 2009). Tahapan kehilangan cairan tubuh dilakukan sehabis proses fiksasi dengan merendam jaringan kedalam alkohol bertingkat secara berturut-turut dengan memakai alkohol 70% selama 3 jam, dilanjutkan dengan alkohol 95% selama 3 jam, dan terakhir dengan alkohol 100% selama 1 jam (Hewitson 2009).
3. Penjernihan
Tahapan penjernihan bertujuan untuk mengeluarkan alkohol dari jaringan hasil kehilangan cairan tubuh dan menggantinya dengan cairan yang sanggup berikatan dengan parafin. Sisa alkohol yang masih ada dalam jaringan akan menyebabkan parafin tidak sanggup masuk tepat sehingga jaringan akan sukar dipotong dengan mikrotom. Perendaman organ yang terlalu usang (lebih dari 24jam) sanggup menyebabkan organ menjadi keras dan rapuh. Larutan yang digunakan pada proses clearing diantaranya yakni : Ada banyak materi kimia yang sanggup digunakan sebagai clearing agent yaitu kloroform, benzena (benzol), xylena (xylol), cedar wood oil, benzyl benzoate, atau methyl benzoate (Zulham, 2009).
4. Pembenaman
Pembenaman atau infiltration yakni proses penanaman paraffin kedalam jaringan untuk menggantikan larutan penjernih. Larutan penjernih yang tersisa sanggup menkristal dalam jaringan dan menciptakan jaringan menjadi ringkih ketika pemotongan, sehingga akan menghasilkan jaringan yang kurang baik (Zulham 2009). Infiltrasi dengan memakai parafin dikerjakan dalam panggangan dengan suhu 56 - 60°C. Infiltrasi awal dilakukan dengan gabungan larutan penjernih kemudian dilanjutkan dengan parafin murni selama 30-60 menit dan diulangi sebanyak tiga kali.
5. Pengecoran
Pengecoran yakni proses pembuatan blok-blok parafin berisi jaringan yang akan dipotong di mikrotom. Pengecoran dilakukan dengan menyusun jaringan yang telah diinfiltrasi dengan memakai pinset panas. Jaringan disusun dalam histoplate kertas yang dibentuk ibarat cetakan es kerikil berbentuk kubus dan diisi sedikit parafin cair. Setelah jaringan selesai disusun, parafin cair segera dituangkan sampai menutupi histoplate dan biarkan mengeras.
6. Pengirisan jaringan
Pengirisan jaringan yakni proses pemotongan blok parafin dengan memakai alat mikrotom pada ketebalan tertentu (Zulham, 2009). Blok parafin dipotong berbentuk dadu dan dipasangi kayu atau holder untuk menahan organ yang telah diparafin pada proses pemotongan. Tahapan selanjutnya yakni penempatan blok pada mikrotom. Hal-hal yang perlu dipersiapkan sebelum proses pemotongan antara lain: memersiapkan pisau mikrotom yang tajam, memersiapkan kuas dan beling preparat, mengatur ketebalan potongan mikrotom, memersiapkan waterbath/paraffin stretcher/hot plate dengan suhu 55°C, air dan zat perekat mirip albumin meyer (50% albumin dan 50% gliserin) (Hewitson, 2009; Jusuf 2009). Pemotongan dilakukan dengan memasang blok preparat di mikrotom dan menggerakkannya kearah pisau, pita paraffin yang mengandung jaringan kemudian dipindahkan dengan kuas ke beling preparat yang telah dilapisi albumin meyer kemudian diletakkan pada hot plate sampai albumin meyer kering dan jaringan terkembang.
7. Pewarnaan
Pewarnaan merupakan proses donasi warna pada pembuatan jaringan yang telah dipotong sehingga warna jaringan menjadi kontras dan gampang dilakukan pengamatan dengan mengguakan mikroskop (Jusuf, 2009). Pewarnaan yang sering digunakan yakni yakni pewarnaan inti dan sitoplasma sel dengan memakai Hematoksilin-eosin (HE). Pewarnaan HE memakai dua zat warna yaitu hematoksilin untuk mewarnai inti sel (biru/ basofilik) dan counterstain eosin untuk mewarnai sitoplasma sel (merah muda). Jenis hematoksilin yang sering digunakan yakni Mayer, delafied, Erlich, Harris, Bullard dan Bohmer, sedangkan counterstaining yang digunakan yakni eosin, safranin, dan phloxine.
