Asam nukleat baik DNA maupun RNA bisa dipotong dengan memakai suatu enzim yaitu nuklease. Enzim nuklease yang bisa memotong RNA disebut ribonuklease atau Rnase, sementara enzim yang bisa memotong DNA disebut deoksiribonuklease atau Dnase. Beberapa nuklease hanya memotong urutan asam nukleat yang single strand dan apa pula yang bisa memotong asam nukleat yang double strand. Nuklease ada dua macam yakni eksonuklease yang bisa memotong molekul asam nukleat single strand atau beberapa oligonukleotida pendek yang hanya mengenali salah satu ujung asam nukleat, yaitu ujung 5′ atau ujung 3′; sementara endonuklease mampu memotong asam nukleat di dareah tengah daru sekuens asam nukleat yang bisa mengenali kawasan spesifik pada urutan asam nukleat (Clark, 2010; Howe, 2007; Murray et al., 2009).
Enzim restriksi endonuklease ialah enzim yang berperan untuk memperoleh suatu urutan DNA dengan memotong genom DNA menjadi fragmen-fragmen dengan cara memotong ikatan fosfodiester pada untaian DNA. Enzim restriksi yang diproduksi oleh basil dinamakan endonuklease yang secara tipikal bisa mengenali 4 – 8 bp urutan nukleotida yang spesifik. Urutan nukleotida yang spesifik tersebut dinamakan restriction sites yang secara umum merupakan sekuens palindromic (run back) yang pendek dengan pola urutan sekuens yang sama dikala dibaca pada arah 5′ → 3′ (Howe, 2007; Lodish et al., 2003; Ream et al., 2003). Enzim restriksi endonuklease dimanfaatkan untuk proses memotong kawasan DNA tertentu. Pada Gambar 1 ditunjukkan enzim restriksi EcoRI yang bisa mengenali enam urutan nukleotida spesifik yang lalu dipotong menjadi dua. Sementara beberapa pola enzim restriksi dengan kawasan spesifiknya disajikan pada Tabel 1.
 |
| Gambar 1. Suatu double strand dari DNA yang dipotong oleh enzim restriksi EcoRI (Lodge et al., 2007). |
Tabel 1. Beberapa pola endonuklease dengan kawasan spesifiknya (Lehninger et al., 2000).
Enzim restriksi endonuklease dibagi menjadi tiga tipe dengan karakteristik yang berbeda-beda dan disajikan dalam Tabel 2.
Tabel 2. Karakteristik dari masing-masing tipe endonuklease (Howe, 2007; Reece, 2004).
Adapun cara kerja enzim endonuklease tersebut berbeda-beda. Enzim endonuklease tipe II telah diketahui strukturalnya yang sisi katalitiknya tersusun atas 5 macam protein sekunder dalam bentuk β-sheet yang diapit oleh 2 protein sekunder dalam bentuk α-heliks (Gambar 2). Enzim restriksi endonuklease tersebut sanggup melaksanakan ‘scanning’ pada untain molekul DNA kalau tidak menemukan restriction sites yang spesifik. Peristiwa tersebut dinamakan mekanisme sliding. Mekanisme sliding tersebut melibatkan pergerakan di sepanjang lekukan DNA. Namun enzim restriksi endonuklease tersebut akan mengubah konformasinya dikala mengenali kawasan restriction sites yang spesifik. Ketika sudah mengenali kawasan spesifik, maka enzim tersebut akan memotong dua ikatan gula deoksiribosa dengan fosfat dari double helix DNA yang berbeda dan menghasilkan gugus 3′ hidroksil (OH) dan gugus 5′ fosfat (PO4-). Selanjutnya DNA tersebut menjadi fragmen-fragmen yang sesuai dengan kawasan pemotongannya. Enzim endonuklease tidak selamanya memotong DNA menjadi fragmen yang ujungnya simetris (blunt ends), namun ada juga yang ujungnya asimetris (sticky ends) (Gambar 3). Pola belahan simetris atau tidaknya tergantung kinerja enzim endonuklease menyerupai yang tertera pada Tabel 1(Allison, 2007; Reece, 2004).
Gambar 2. Struktur enzim restriksi BamHI yang mengikat DNA. Enzim tersebut mengenali double strand dari DNA dengan sekuens spesifik 5′-GGATCC-3′, yang selanjutnya memecah ikatan fosfodiester antara dua residu G. Hasilnya ialah berupa dua fragmen yang ujungnya sticky ends. Pada gambar tersebut warna hijau dan biru mengatakan subunit protein dimer yang identik (Reece, 2007).
Gambar 3. Contoh pola pemotongan enzim restriksi endonuklease. Enzim tersebut menghidrolisis ikatan fosfodiester yang menghasilkan deretan 5′–PO4– dan 3′–OH yang bab terminalnya berbentuk asimetris atau sticky ends (BamHI) dan bentuk simetris atau blunt ends (SmaI) (Allison, 2007).
Enzim BamHI ini mempunyai kofaktor berupa ion Mg2+, sehingga dalam mekanisme protokol restriksi suatu sekuens DNA terkadang diberi MgCl. Kation bivalen Mg2+ dari MgCl tersebut berfungsi dalam proses pemotongan plasmid yang diperlukan untuk meningkatkan acara enzim restriksi (Ausubel, 2003; Reece, 2004). Adapun kinerja enzim BamHI tersebut bisa memotong ikatan fosfodiester pada urutan DNA pada sisi:
5′ G↓G-A-T-C-C 3′
3′ C-C-T-A-G↑G 5′
Enzim restriksi tersebut bisa mengenali urutan nukleotida yang sama (G-G), sehingga BamHI disebut juga sebagai isoschizomer. Hasil belahan oleh enzim BamHI berupa deretan 5′–PO4– dan 3′–OH yang bab terminalnya berbentuk asimetris atau sticky ends. (Ausubel, 2003; Becker et al., 1996).
Enzim BamHI bekerja dengan cara melaksanakan scanning sekuens non-spesifik di sepanjang DNA dengan cara meluncur (sliding), sesudah itu dikala enzim tersebut menemukan sekuens spesifik berupa 5′ G-G-A-T-C-C 3′ maka akan berupa konformasinyan dan sisi katatiliknya bekerja untuk memotong ikatan fosfodiester antara nukleotida G menjadi fragmen yang terpisah (Allison, 2007).
